流式细胞DNA分析

流式细胞DNA分析注意事项

流式细胞仪并非是完全自动化的仪器，准确的实验结果还需要准确的人工技术配合，所以标本制备需要规范，仪器本身亦需要质量控制。

(一)流式细胞术免疫学检测的影响因素和质量控制

流式细胞术在免疫学中有着广泛的应用，其免疫荧光染色的标本制备非常重要，常常由于标本制备过程中出现人为非特异性荧光干扰(尤其在间接免疫荧光染色中)或细胞浓度低等影响检测结果。解决这些影响因素的方法如下：

(1)确保标本上机检测前的浓度为1X106细胞/ml，细胞浓度过低直接影响检测结果。

(2)使用蛋白封闭剂，封闭非特异结合位点，尤其在间接免疫荧光标记时必不可少。常用的蛋白封闭剂为0.5%牛血清白蛋白和1%胎牛血清。

(3)荧光抗体染色后充分洗涤，注意混匀和离心速度，减少重叠细胞和细胞碎片。

(4)设置对照样品，采用与抗体来源同型匹配的无关对照和荧光抗体的本底对照。

(5)判定结果时，应注意减去本底荧光，为使免疫荧光的定量分析更精确，应用计算机程序软件，用拟合曲线方法从实验组的曲线峰值中减去对照组的曲线峰值，可以得到更准确的免疫荧光定量结果。

(6)注意染色后避光，保证细胞免疫荧光的稳定。

(二)DNA倍体分析的质量控制仍没有统一的标准，各文献报道的实验结果差异较大，1993年10月美国癌症研究组织制定了FCMDNA测定的统一标准，我们根据这些标准并结合国内有经验的专家多年的实践，对FCM的DNA分析技术的质控和注意事项进行说明。

(1)手术切除的新鲜标本或活检针吸标本取材时，要避免出血坏死组织。

(2)标本采集后要及时固定或深低温保存，以免组织发生自溶，DNA降解，而造成测试结果的误差。

(3)固定剂要采用对组织细胞穿透性强的浓度，70%的乙醇固定效果较好。

(4)单细胞悬液制备过程中，注意将待测细胞成分分离出来，减少其他成分的干扰，并注意不要损伤该群细胞。

(5)细胞样品的采集要保证足够的细胞浓度，即1X106细胞/ml，杂质、碎片、团块和重叠细胞应8%，与肿瘤细胞的异质性有关。另外，DNA倍体分析时，同源组织的不同个体会出现10%的漂移。

(4)DNA倍体标准的质量控制，采用相同个体同源正常组织、同样固定方法、相同的样品处理方法、相同的染色方法、同步染色、同样的仪器检测条件、正常的二倍体组织作为内标准。